间充质干细胞治疗卵巢早衰，效果显著！
卵巢早衰，也称为卵巢功能不全，是一个具有挑战性的生殖问题，会导致 40 岁以下女性卵巢功能丧失。尽管进行了大量研究，但在大多数情况下，卵巢早衰 的原因仍然是个谜。卵巢早衰 的特点是雌激素不足；血清促性腺激素水平升高；最重要的是闭经。约 1–3% 的女性均有不同程度的卵巢早衰，但其在原发性闭经女性中的患病率高达 10–28%，在继发性闭经女性中的患病率约为 4–18%。卵巢早衰 对育龄妇女来说是一种毁灭性的打击。卵巢早衰 患者的卵巢以次级卵泡丢失和卵泡发生停滞为特征，这导致雌激素产生减少或消除和不育。卵巢早衰 患者卵巢卵泡耗竭的机制很可能是加速的卵泡闭锁，但详细的发病机制尚未完全了解。此外，雌激素对于正常卵泡发生是必不可少的，并且在 卵巢早衰 患者中减少。此外，卵巢早衰 与严重的健康后果有关，包括心理困扰、骨质疏松症、自身免疫性疾病、缺血性心脏病、阿尔茨海默病、代谢综合征、糖尿病和死亡风险增加。
对于希望怀孕的 卵巢早衰 患者，目前唯一的选择是接受供体卵子。最近，多项临床前证据表明，使用骨髓间充质干细胞 (BMSC) 的细胞疗法 (CT)可以恢复受损卵巢组织的结构和功能。CT 是基于突破性的科学发现和技术进步。CT 被定义为活细胞转移或植入受损组织， CT 主要可根据细胞来源（自体或同种异体移植）或治疗适应症（例如，血液学、生殖学或神经学病理学）进行分类。CT 的其他潜在治疗应用包括治疗泌尿问题或传染病；重建关节中受损的软骨；并帮助患有神经系统疾病、大脑或脊髓损伤、心脏病、糖尿病以及癌症患者。
人干细胞在基于细胞的疗法中发挥着关键作用并具有重要的潜在应用，这些疗法代表了包括生殖功能障碍在内的多种疾病的可替代方案。我们对用BMSC 治疗的 卵巢早衰 动物模型进行的临床前研究表明，BMSC 治疗的动物恢复了卵巢功能，导致卵泡生成和雌激素产生。在另一项使用顺铂诱导颗粒细胞凋亡的研究中，研究者证明了 BMSCs在体外减少了细胞凋亡。此外，与未治疗的 卵巢早衰 组相比，MSC 治疗组在 1 个月后显示窦卵泡计数和雌二醇 (E2) 增加. 根据这些结果，BMSCs 可能会在卵泡和激素方面恢复过早衰竭的卵巢。干细胞在治疗疾病中的作用与其独特的再生能力有关，从而产生不同的细胞和组织。
干细胞疗法可以直接应用，如在骨髓移植的情况下，或通过使用由干细胞在体外扩增的成熟细胞。如今，来自健康捐赠者的捐赠细胞、组织和器官通常用于替代患病受损的组织。在这项研究中，我们报告了用 BMSCs 治疗卵巢早衰的生物学效应的早期观察结果。
案例：
该研究获得了奥古斯塔大学机构审查委员会（编号 723327-2）的批准，并且在患者签署知情同意书后才启动研究程序。入组和排除标准总结在如下表格1，此外，将间充质干细胞注射到右侧卵巢之前和之后12个月的激素水平总结在表中的表2中。
表一：
|
入组标准 |
排除标准 |
|
1. 18岁以上 2. 卵巢早衰 的诊断（两次绝经期 FSH 水平 > 40 IU/L 或原发性或继发性闭经至少 3-6 个月） 3.正常核型46,XX 4.至少有一个卵巢 5.至少单侧输卵管通畅 6. 可接受子宫解剖 7、无男性不育症 8.甲状腺功能正常 9. 计划和/或愿意尝试怀孕作为实验的一部分 10.无其他原因导致女性不孕 |
1. 目前怀孕或哺乳 2. 过去 3 年内有当前妇科恶性肿瘤的病史或证据 3.附属肿块的存在 4. 重大心理健康障碍 5.滥用或依赖其他活性物质 6. 不适合/不愿接受腹腔镜检查 7. 使用妊娠期禁忌的医疗手段 |
表2：
|
参考范围 |
术前 |
1周 |
1个月 |
3个月 |
6个月 |
9个月 |
12个月 |
||||||||
|
P1 |
P2 |
P1 |
P2 |
P1 |
P2 |
P1 |
P2 |
P1 |
P2 |
P1 |
P2 |
P1 |
P2 |
||
|
AMH |
(1.1–53.5 纳克/毫升) |
< 0.0140 |
< 0.015 |
0.0140 |
< 0.015 |
< 0.0140 |
< 0.015 |
< 0.014 |
< 0.015 |
< 0.1 |
* |
< 0.0140 |
< 0.015 |
< 0.1 |
* |
|
FSH |
(3.0–8.0 国际单位/升) |
89.4 |
150.8 |
132 |
161.4 |
91.2 |
149.9 |
78.1 |
147.1 |
68.5 |
* |
89.2 |
150.1 |
80.3 |
* |
|
LH |
(2.0–12.0 国际单位/升) |
45.8 |
67.0 |
48.3 |
69.5 |
36.3 |
75.2 |
37.3 |
67.8 |
41.4 |
* |
45.0 |
71.0 |
41.3 |
* |
|
CA125 |
< 36 千单位/升 |
11 |
10.2 |
13 |
20.6 |
13 |
12.0 |
11 |
10.6 |
2.9 |
* |
|
12.3 |
|
* |
|
雌二醇 |
(27–123 皮克/毫升) |
< 10.896 |
* |
19.88 |
< 5.0 |
14.165 |
< 5.0 |
< 10.9 |
< 5.0 |
26.15 |
* |
21.79 |
10.9 |
19.3 |
* |
|
黄体酮 |
(0.1–0.7 纳克/毫升) |
0.1887 |
0.5 |
|
0.2 |
0.2201 |
< 0.1 |
< 0.16 |
< 0.1 |
< 0.157 |
* |
0.2201 |
< 0.1 |
* |
* |
P1:患者1；P2：患者2；*：数据不可用
病例一：
一名 36 岁的白人女性因继发性闭经4年就诊。她是来自加拿大多伦多的儿科牙医。她于 2009 年结婚，并立即开始服用复方口服避孕药 3 年以推迟生育。在她于 2012 年 1 月停止服用口服避孕药试图怀孕后，她的月经再也没有回来，并且出现了闭经。她的生殖内分泌和不孕症医师 (REI) 诊断出她患有 卵巢早衰 FSH (110 IU/L)。从那以后，她一直断断续续接受激素替代疗法 (HRT) 来控制更年期症状。她于 2016 年 3 月停止使用任何外部激素，仅使用产前维生素作为补充剂。她是 gravida 0，para 0 (G0 P0)。她11岁初潮，每28天来一次月经。她否认有性病史。没有其他慢性疾病，过去的手术史仅包括拔除智齿。她没有已知的过敏症，并且她否认使用过烟草、酒精或其他药物。她的家族史中只有一位父亲患有糖尿病。她的体格检查显示 Tanner V 期解剖结构正常。完整的体格检查结果见表的表3。 卵巢早衰 的诊断于 2012 年 5 月根据实验室测试得到证实，该测试显示持续高血清 FSH (110 IU/L) 和黄体生成素 (LH) (53.89 IU/L)，以及低 E2 (< 10 pg/ml) . 她的核型（46，XX）正常，脆性 X 综合征（ FMR1）的基因检测结果为阴性). 她接受了大约 6 个月的脱氢表雄酮治疗，然后在 2013 年 7 月进行的后续超声检查显示没有窦状卵泡。她开始出现更年期症状（潮热和阴道干燥），并于 2013 年 8 月接受了初级保健医生的断断续续的激素替代疗法以缓解症状。他们很少在周期中发现一两个卵泡，但她没有排卵. 她希望治疗不孕症，但出于宗教原因拒绝捐卵。入院时，她的所有常规术前实验室检查结果均正常，如表3所示。
表3：
|
|
病例一 |
病例二 |
|
身体检查 |
一般：警觉和定向，无急性窘迫 呼吸系统：听诊肺部清晰，呼吸不费力，呼吸音正常，胸壁对称扩张 心血管：心率正常，节律规律，无杂音，无奔马律，四肢均等脉搏良好 乳房：无包块，无压痛，无分泌物 胃肠道：柔软、无压痛、无扩张、肠鸣音正常 泌尿生殖系统：双合诊检查、窥器检查和外生殖器均为正常范围 肌肉骨骼 正常运动范围 正常强度 无压痛 无肿胀 外皮：温暖、干燥、粉红色 神经系统：警觉、定向、无重要缺陷 精神病学：协助活动正常，适当的情绪和情感，正常的判断力 |
一般检查：无急性窘迫 眼睛：眼外肌运动完好，结膜正常 HENT：头颅正常，听力正常 呼吸：听诊肺部清晰，呼吸无困难 心血管：心率正常，节律正常 胃肠道：柔软，无膨胀 肌肉骨骼：正常运动范围，正常强度 外皮：温暖、干燥、无皮疹 神经系统：警觉，定向 精神病学：协助活动正常，适当的情绪和影响 腹部检查：大的中线切口，几个小的腹腔镜切口 骨盆检查：外生殖器在正常范围 窥器检查：在正常范围，小型固缩外部操作系统 双手测试：在正常范围 |
|
血液学 |
白细胞 7.0 × 10 3 /mm3 |
白细胞 5.0 × 10 3 /mm3 |
|
红细胞 4.73 × 10 6 /mm3 |
红细胞 4.37 × 10 6 /mm3 |
|
|
血红蛋白 14.1 克/dl |
血红蛋白 12.5 克/dl |
|
|
血细胞比容 42.3% |
血细胞比容 37.4% |
|
|
MCV 89.4 液体 |
MCV 85.7 液体 |
|
|
MCH 29.7 pg |
MCH 28.5 pg |
|
|
MCHC 33.3 克/dl |
MCHC 33.3 克/dl |
|
|
RDW 12.7% |
RDW 13.8% |
|
|
血小板 224 × 10 3 /mm 3 |
血小板 166 × 10 3 /mm 3 |
|
|
MPV 9.4 fl |
MPV 10.0 fl |
|
|
凝血酶原时间 10.9 秒 |
凝血酶原时间 12.0 秒 |
|
|
INR 0.9 |
INR 1.0 |
|
|
APTT 35.2 秒 |
APTT 29.8 秒 |
|
|
尿妊娠试验阴性 |
尿妊娠试验阴性 |
病例二：
一名 42 岁的白人女性，G0 P0，因继发性闭经就诊。她是一名科学家，在费城坦普尔大学获得博士学位，专注于慢性阻塞性肺病。她表现出高 FSH (155 IU/L) 和正常核型 (46,XX)。直到 2014 年，她的月经一直正常。然后，她被诊断出患有巨大的左侧卵巢囊肿，需要进行手术。她接受了机器人腹腔镜检查，但这必须改为中线开腹手术，并且她接受了左侧卵巢切除术和子宫肌瘤切除术。手术后，她出现继发性闭经，随后被诊断为 卵巢早衰。她经历过一些更年期症状，但否认为此使用过任何药物。她和她的丈夫一直在积极尝试通过定期性交来怀孕，但没有尝试任何额外的生育治疗。她的子宫输卵管造影正常，超声显示右侧卵巢正常。她过去的病史仅包括偶尔的低血压和扁桃体切除术。她没有已知的过敏症，并且她否认使用过烟草、酒精或其他药物。她进行了正常的体格检查和实验室检查，其结果列于表中的表3。患者寻求不孕症治疗，但出于文化原因拒绝捐卵。根据对他们的医疗、手术和社会史以及体格检查的筛选，她和病例 1 中的患者都符合纳入本研究的标准。
方法：
自体骨髓间充质干细胞干细胞的制备
患者在全身麻醉下，该程序涉及使用浸泡在肝素中的骨髓抽吸套件从髂骨（髂后嵴）收集骨髓组织。 收获约150ml骨髓组织并进行浓缩。我们使用了美国食品和药物管理局批准的 2 级医疗 Angel 设备，能够在大约 20 分钟内浓缩 160 毫升的骨髓抽吸物。将收集的细胞沉淀重悬于 4 ml 骨髓有核细胞浓缩物（约 5 × 10 8 个总有核细胞和平均 5-15*106个 MSC）中。
右卵巢腹腔镜直注
使用腹腔镜将收获的 BMSCs (4 ml) 直接注射到右侧卵巢中。将相似量（4ml）的生理盐水注射到左侧卵巢中作为对照。在病例 2 中，没有这样做，因为患者之前接受过左卵巢切除术。使用 5 毫米注射器（22 号针头）进行注射。一名助手使用无创抓持器牢固地固定了卵巢（图 1）。外科医生通过卵巢包膜的一个入口将针头插入卵巢中心，并在 5 分钟的时间内缓慢注射细胞浓缩液，使卵巢逐渐扩张。注射完所有溶液后，将针头再原位放置 5 分钟，作为塞子以避免注射的细胞回流出卵巢。
图一：
间充质干细胞注射后卵巢形态学变化。
a注射前萎缩的卵巢（绿色箭头）（低倍率）。
b注射前萎缩的卵巢（绿色箭头）（放大）。
c腹腔镜抓持器（绿色箭头）通过干细胞注射器（红色箭头）在注射过程中稳定卵巢。
d萎缩的卵巢（绿色箭头）在注射过程之前稳定在原位。
e干细胞注射。
f卵巢（绿色箭头) 注射过程接近尾声（注意卵巢肿胀和明显增大）。
经阴道超声成像
MSC 植入后，使用标准经道超声技术在 1 周、1 个月、3 个月、6 个月、9 个月和 12 个月时测量子宫内膜厚度、卵巢体积和窦状卵泡计数 (AFC)。
血清激素水平的生化评估和症状评估
在 1 周和 1、3、6、9 和 12 个月检查移植后 1 年的血清激素概况。检查的激素包括 FSH、LH、AMH、E2 和黄体酮。使用标准实验室技术通过放射免疫测定法对血清激素进行定量。两名患者向研究协调员自我报告了症状。
结果：
自体骨髓间充质干细胞经腹腔镜注射到右侧卵巢。注射后，右侧卵巢的体积显着增加，证实了正确的注射和卵巢内的细胞输送。根据研究方案在不同时间点监测卵巢体积和激素水平。参照图3，图4，图5。
图2：
间充质干细胞植入患者 1 卵巢后测量的卵巢体积（以立方厘米为单位）
图3：
在间充质干细胞卵巢植入前后量化血清雌激素水平。箭头表示间充质干细胞植入后 7 个月内恢复的月经
图4：
血清促卵泡激素 (FSH) 水平报告了间充质干细胞卵巢植入前后
图5：
检查血清黄体生成素 (LH) 水平在间充质干细胞卵巢植入前后
病例一：
测试卵巢的卵巢体积从注射前的 0.63 cm 3增加到随访第 1 周的2.5 cm 3 ，然后是 3 周后的2.05 cm 3 。第 3 个月和第 6 个月的随访显示卵巢体积稳定，测量值分别为 2.3 cm 3和 2.7 cm 3，在 7 个月恢复月经后体积有所增加（见图2）。这些数据表明右侧卵巢对 BMSC原位注射有特异性反应。此外，我们注意到 BMSC 植入后血清雌激素水平总体升高（见图3）。在 MSC 植入前和 MSC 植入后 1 周，雌激素水平 < 10.9 pg/ml，并且增加了三倍，达到 20 pg/ml（见图 3）。MSC 注射后 6 个月，雌激素水平达到 26.1 pg/ml。FSH 和 LH 的血清水平也有变化，见图4和图5。
病例二：
我们在 9 个月的随访中观察到雌激素水平升高。FSH、LH 或黄体酮水平没有变化。不幸的是，由于该患者的不依从性，我们遗漏了一些关于血清激素组的数据。两名患者均报告更年期症状有所减轻，例如潮热、盗汗和性交疼痛。两名患者在 BMSC 植入后 7 个月均报告了一次月经事件（阴道出血 3 天，量为轻度至中度）。
讨论：
卵巢早衰 是一种毁灭性的疾病，目前的治疗选择非常有限，通常无法解决患者的问题和需求。卵巢早衰 会干扰生育能力并引起更年期症状以及严重的心理后遗症。总之，这些挑战需要多学科的诊断和治疗方法以及特别关注。目前已建立的治疗 卵巢早衰 的方式主要是通过使用外部 HRT来针对低雌激素相关症状。对于患有自发性 卵巢早衰 的年轻女性，尚无关于理想激素替代策略的对照研究，缺乏关于 卵巢早衰 年轻女性理想激素替代策略的循证指南是一个明显的挑战。
由于 BMSCs 具有恢复许多器官生理功能的能力，全球有 344 项注册临床试验试图评估基于 BMSC 的 CT 治疗多种人类疾病的潜力。随着临床前研究的推进，BMSCs已被证明可有效治疗多种疾病。此外，MSCs 已显示在几乎所有组织中。它们可以很容易地从骨髓、脂肪组织、脐带、胎盘、肌肉和肺中分离出来，并可以在体外成功扩增。最好在干细胞治疗中使用新鲜分离的MSCs，因为已经表明MHC II 分子在体外可以增加干细胞的扩增，这可能会增加它们的同种异体性。不过，最近的研究表明，MSC 的同种异体性对其在伤口愈合中的植入没有显着的不利影响。多项研究还证明了干细胞生物活性因子（分泌蛋白组）恢复卵巢功能和再生的能力。早期的研究主要将 MSC 潜在治疗的效果归因于这些细胞局部分化为各种组织类型的能力。MSCs 对血管组织的修复作用，发现血管再生涉及两种机制：MSCs 产生内皮细胞、血管平滑肌细胞和其他细胞类型的多能分化能力，以及它们分泌各种营养因子的能力。这些因子可有效促进血管生成、抑制细胞凋亡和调节免疫反应。
第一个病例的结果表明，使用自体 BMSCs 注入 卵巢早衰 患者的卵巢具有可测量/可量化的效果，具有可喜的结果，可能使该方法成为未来这些患者的潜在治疗选择。在我们的研究中，患者在全身麻醉下在相同的环境中进行了 BMSC 采集和注射，这对于对该试验感兴趣的患者来说是广泛可接受的。在一项使用 MSCs 治疗 卵巢早衰 的类似研究中，研究人员声称，对 卵巢早衰 患者使用类似方案导致一名患者自然怀孕。
我们的数据显示对卵巢体积的直接影响在以下评估中持续存在。通过 1 周和 1、3、6 和 9 个月的随访，血清雌激素水平持续持续增加。这种低雌激素状态的部分纠正可以解释患者报告的几种绝经期症状的逆转，特别是在 MSC 植入后约 3 个月及以后注意到的。有趣的是，左侧对照卵巢的体积没有增加。两名患者都报告了 1 例自发性月经事件，该事件发生在 BMSC 植入后约 7 个月后，经过几年的绝对闭经，这可能是由于 E2 激素水平的部分校正。与治疗前大小相比，右侧（治疗后）卵巢的大小增加，并且与左侧（对照）卵巢相比，表明恢复了卵泡生成以及可能刺激了这些注射卵巢的血管生成。
结论：
本次研究揭示了在自体 BMSC 植入 卵巢早衰 患者的卵巢后观察到的令人鼓舞的初步数据。将 BMSC 输送到卵巢中可减少术前评估中观察到的更年期症状。接受治疗的患者能够在植入 MSC 后 7 个月内恢复月经。此外，我们的研究中没有报告并发症或安全问题。
