干细胞治疗强制性脊柱炎
摘要
目前的研究评估了 5 名强直性脊柱炎 (AS) 患者。患者接受了脐带间充质干细胞（uMSC）的静脉输注。在 uMSC 治疗期间评估并记录所有治疗反应和不良反应。尽管有3名患者在静脉注射uMSCs后2-6小时内出现轻微短暂发热，但所有患者均未观察到严重不良反应。治疗后，Bath强直性脊柱炎疾病活动度和Bath强直性脊柱炎计量指数下降，但Bath强直性脊柱炎功能指数增加。3名患者的红细胞沉降率降低，1 名患者的 C 反应蛋白水平显着降低。所有患者的 AS 症状均得到缓解。本研究表明，静脉输注uMSCs是安全的，患者耐受性良好，可有效缓解疾病活动性和临床症状。未来，应该招募更多的 AS 患者来对 uMSC 治疗进行系统评估。
介绍
强直性脊柱炎（AS）是一种慢性进行性炎症性疾病，主要影响骶髂关节和中轴骨骼（脊柱），少数情况下也影响周围关节和其他关节外器官，包括眼睛、皮肤和心血管系统。目前，AS的发病机制尚不清楚。已确定 AS 患者中分化簇 CD27+ B 细胞数量减少，而 CD86 +和 CD27 - CD95 + B 细胞亚群数量增加。此外，循环 CD4 + CD28 -和 CD8 +的百分比与健康人相比，AS 患者的 CD28 - T 细胞有所增加。在 AS 患者中也观察到 Th17 和调节性 T 细胞 (Treg) 之间的偏向平衡，AS 患者中 Th17 水平升高而 Treg 水平降低。既往研究表明，血清和关节内促炎细胞因子如肿瘤坏死因子（TNF）-α的浓度可能反映疾病活动度，表明抑制TNF-α可能缓解AS症状。
除了包括非甾体类抗炎药 (NSAID) 和柳氮磺胺二脒 (SSZ) 在内的传统疗法外，人们还开发了许多新策略来针对 AS 发病机制中涉及的不同途径。环氧化酶 2 抑制剂，包括塞来考昔、罗非考昔和帕米膦酸以及抗 TNF-α 疗法已被用作 AS 的一线治疗。造血干细胞移植在临床上也被用于治疗严重的自身免疫性疾病，例如AS。
间充质干细胞（MSC）是具有强大免疫调节活性的成体干细胞。MSC 能够调节B 细胞分化、T 细胞活化和增殖，并诱导调节性 T (Treg) 细胞的产生。此外，MSC 还能抑制辅助性 T (Th)17 细胞的生成和白细胞介素 (IL)-17 的分泌。先前的研究已经确定了间充质干细胞对各种类型自身免疫性疾病和糖尿病的治疗效率。考虑到 MSC 对 T 细胞和 B 细胞活性调节的影响，有人提出 MSC 的施用可能对 AS 患者产生治疗作用。在当前的研究中（Clinical Trials.gov 标识符：NCT01420432），评估了 AS 患者脐带间充质干细胞（uMSC）移植的治疗和不良反应。
患者和方法
患者
山东大学第二医院血液与细胞治疗科入组5例AS患者（4男1女），年龄17-44岁。所有患者均符合改良纽约 AS 标准的诊断标准。所有患者均接受非甾体类抗炎药（NSAIDs）、甲氨蝶呤（MTX）、柳氮磺胺二脒（SSZ）、羟氯喹或低剂量类固醇治疗，并且这些药物的剂量在开始研究前4周内保持不变。患有以下一种或多种疾病的患者被排除在本研究之外：i) 器官衰竭，ii) 精神病，iii) 严重传染病，包括结核病 (TB)、获得性免疫缺陷综合征 (AIDS)，iv) 怀孕，以及 v) 对 MSC 培养的培养基成分和人白蛋白过敏。本研究经山东大学第二医院伦理委员会批准，并获得每位患者的书面知情同意书。
方法
脐带取自山东大学第二医院产科健康产妇（25-30岁）。捐赠者没有癌症或遗传病家族史。评估血清以排除乙型肝炎、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒、EB病毒、巨细胞病毒和梅毒感染。山东大学第二医院伦理委员会批准了本研究，并获得了捐赠者的知情同意。按照山东大学第二医院药品生产质量管理规范（GMP）实验室的标准，采用前述方法从脐带组织中分离出MSC并进行扩增。
疗效终点
在MSC输注之前对患者进行检查，使用红细胞沉降率（ESR）、C反应蛋白（CRP）水平和Bath强直性脊柱炎疾病活动指数（BASDAI）来评估AS的严重程度。使用Bath强直性脊柱炎功能指数（BASFI）评估身体功能，并使用Bath强直性脊柱炎计量指数（BASMI）评估活动能力，枕骨到墙壁的距离（以评估颈椎运动）、Schober 试验（评估腰椎运动程度）和 Patrick 试验（Gaenslen试验，检查髋关节和膝关节是否异常）。主要疗效终点是根据国际脊柱关节炎协会反应标准 (ASAS20) 的评估实现 20% 的改善。ASAS20 被定义为至少三个领域，以下四个领域的改善超过 20%：患者的疾病活动总体评估 (PaGA)、总背痛 [根据视觉模拟量表 (VAS)]、功能性（通过 BASFI 评估、 VAS 量表）和炎症（BASDAI 评分平均值），其余方面无恶化（定义为恶化 ≥20% ，且净恶化 ≥10 U）（29）。次要疗效终点是 ESR、CRP 水平、Schober 检验和 Patrick 检验。ESR和CRP水平降低至正常范围；Schober和Patrick的测试结果从阳性变为阴性被视为本研究中疗效的确认。在 uMSC 输注之前，所有患者均已服用沙利度胺、SSZ 和/或 NASID 至少 4 周。SSZ的剂量为0.5-1g，每天给药3次（tid）。沙利度胺是一种抗 TNF-α 药物，剂量为 100 mg，每天一次。给予非甾体抗炎药，例如75毫克/天双氯芬酸钠（北京诺华制药有限公司，中国北京）和60毫克/天洛索洛芬钠（Daiichi-Sankyo，日本东京）。安全性评估包括研究期间接受 uMSC 输注的所有患者。记录与 uMSC 输注相关的任何不良事件，并由研究者评估其严重程度。基础疾病引起的不良事件被排除在安全性评价之外。
统计分析
数据表示为平均值±标准差。未配对的学生 t 检验用于比较组之间的差异。使用SPSS 20.0软件(IBM Corp., Armonk, NY, USA)进行统计分析。P<0.05被认为表示具有统计学显着性差异。
临床结果
案例1
患者男性，34岁，腰痛20年。双侧髋关节疼痛与晨僵交替，每天约 20 分钟。体格检查确定肖伯氏试验阳性，帕特里克氏试验阳性，枕骨距墙距离5厘米，胸椎活动度3厘米。结果，BASDAI、BASMI 和 BASFI 评分分别为 2.95、4.3 和 7。计算机断层扫描显示双侧骶髂关节面呈锯齿状，提示有 AS 骶髂关节炎。实验室检查包括ESR、CRP水平和HLA-B27的评估，其中ESR为10mm/h，CRP为0.6mg/l，HLA-B27阳性。因此，根据修订后的纽约 AS 标准，该患者被诊断为 AS。患者输注8 IU uMSCs（1 IU=1×107uMSCs）最初连续给药 SSZ（口服；1,500 mg/天）、沙利度胺（口服，每天 100 mg）和双氯芬酸钠（口服，每天 75 mg）。患者第二天就出院了。3 个月后，患者接受了第二次 uMSC 输注，剂量为 7 IU。腰痛得到缓解。体检显示肖伯试验阴性，右侧帕特里克试验阳性，左侧阴性，枕骨距墙距离2.5厘米，胸椎活动度3厘米。BASDAI、BASMI 和 BASFI 评分分别为 0.6、6 和 6。实验室检查确定CRP为1mg/l，ESR为22mm/h。6个月后，患者感觉背痛几乎消失，并返回检查。ESR 为 7 mm/h，CRP 水平为 0.5 ng/l，BASDAI，BASMI 和 BASFI 评分分别为 0.5、6 和 6。肖伯试验和帕特里克试验均为阴性，枕骨距墙距离为2.5厘米。1年后，患者已停止所有药物治疗，身体状况保持稳定。
案例2
患者男性，20岁，双侧膝关节疼痛、腰痛2年。体检显示Schober试验阳性，双侧Patrick征阳性；枕骨到墙壁的距离为 3 厘米，胸部活动度为 3 厘米。BASDAI、BASMI 和 BASFI 评分分别为 4.9、5 和 57。CT显示双侧髋关节发生与AS一致的变化。实验室检查结果显示，HLA-B27 呈阳性，ESR 为 53 mm/h，CRP 水平为 7.8 mg/l。根据修订后的纽约 AS 标准，该患者被诊断为 AS。患者接受了 6 IU uMSC 输注。继续治疗，每天 3 次，每次 1 g SSZ，每晚 100 mg 沙利度胺，每天三次 60 mg 洛索洛芬。3个月后，患者感觉膝关节和腰部疼痛减轻，返回检查。体格检查显示Schober试验阳性，双侧Patrick试验阴性，枕骨距墙距离2cm，胸廓活动度3cm。BASDAI、BASMI 和 BASFI 评分分别为 1.35、5 和 9。实验室检查确定CRP水平为0.3mg/l，ESR为3mm/h。6个月后，腰痛几乎消失，实验室检查完成，ESR为5毫米/小时，CRP水平为0.4纳克/升，BASDAI、BASMI和BASFI评分分别为1.3、8和8。双侧帕特里克检测呈阴性，但肖伯检测呈阳性。枕骨到墙壁的距离为2厘米。一年后，患者身体状况稳定，停止治疗。
案例3
患者女性，41岁，腰骶关节及左膝关节疼痛20年。体格检查显示肖伯试验阴性，双侧帕特里克试验阳性，枕骨距墙距离0厘米，胸椎活动度3厘米。结果，BASDAI、BASMI 和 BASFI 评分分别为 5.2、10 和 37。CT提示左侧骶髂关节软骨炎，双侧股骨头坏死II度。实验室检查显示 HLA-B27 阳性，ESR 为 20 mm/h，CRP 水平为 5 mg/l。根据修订后的纽约 AS 标准，该患者被诊断为 AS。患者接受了 6.1 IU uMSC 输注。继续治疗，每日一次 1 g SSZ、100 mg 沙利度胺 quaque nocte (qn) 和 75 mg 双氯芬酸钠 qn。3个月后，腰痛得到缓解，患者返回接受第二次 uMSC 输注，剂量为 6 IU。此时体检显示肖伯氏试验阴性，左侧帕特里克氏试验阳性，右侧帕特里克氏试验阴性，枕骨距墙距离0厘米，胸椎活动度3厘米。BASDAI、BASMI 和 BASFI 评分分别为 2.85、5 和 34.5。实验室检查显示，CRP 水平为 0.3 mg/l，ESR 为 7 mm/h。6个月后，患者偶尔感到腰部疼痛并返回检查。结果显示，Schober 试验和 Patrick 试验均为阴性，枕骨距墙距离为 0 cm，胸椎活动度为 3 cm。BASDAI、BASMI 和 BASFI 评分分别为 2.55、6 和 30.2。实验室检查显示CRP为0。3 ng/l，ESR 为 4 mm/h。一年后，患者停止服用所有药物，身体状况保持稳定。
案例4
患者男性，44岁，有腰骶关节疼痛、胸骨疼痛病史约5年。体格检查显示肖伯氏试验和双侧帕特里克氏试验呈阳性。结果，BASDAI、BASMI 和 BASFI 评分分别为 5.48、2 和 52。CT显示双侧骶髂关节面呈锯齿状，关节间隙较狭窄，提示AS骶髂关节炎。实验室检查显示 HLA-B27 阳性，ESR 为 26 mm/h，CRP 水平为 3.7 mg/l。根据修订后的纽约 AS 标准，该患者被诊断为 AS，并接受了 9.2 IU uMSC 的输注。继续用 0.5 g SSZ tid 和 100 mg 沙利度胺 qn 进行治疗。3个月后，患者返回检查。体检结果显示，肖伯氏试验和双侧帕特里克试验呈阳性。BASDAI、BASMI 和 BASFI 评分分别为 0.6、4 和 5。实验室检查显示CRP水平为0.9mg/l，ESR为12mm/h。该患者因个人原因，现参加6个月随访。一年后，患者身体状况稳定，停止治疗。
案例5
患者感觉腰痛和膝关节疼痛得到缓解，并返回进行第二次输注uMSCs，剂量为6 IU。体检结果显示，肖伯氏试验和左帕特里克氏试验呈阴性，右帕特里克氏试验呈阳性。枕骨到墙壁的距离为 0 厘米，胸部活动度为 3 厘米。BASDAI、BASMI 和 BASFI 评分分别为 4、10 和 0。实验室检查显示CRP水平为2.1mg/l，ESR为12mm/h。6 个月后，患者接受了第三次 uMSC 输注，剂量为 6 IU。体检显示肖伯氏试验和双侧帕特里克氏试验均为阴性。枕骨到墙壁的距离为 0 厘米，胸部活动度为 3 厘米。BASDAI、BASMI 和 BASFI 评分分别为 13、10 和 0。实验室检查显示CRP水平为1.2mg/l，ESR为10mm/h。患者能够参加体育课并进行锻炼。一年后，患者停止服用所有药物，身体状况保持稳定。
结果分析
其中3名患者的ESR明显降低（图3）。1 名患者的 CRP 水平降低并保持稳定，其他 4 名患者的 CRP 水平在正常范围内（≤10 mg/l）（图 4）。BASDAI和BASFI评分的显着下降表明患者的脊柱功能和症状显着改善。BASMI 评分的增加表明治疗后患者的脊柱运动有所改善。具体结果如下： i)治疗前后BASDAI的变化：治疗3个月后患者BASDAI较治疗前明显降低（P<0.05；表1；图5 ））。与治疗前的结果相比，治疗6个月后患者的BASDAI也显着降低（P<0.05；表II；图5）。治疗后 3 至 6 个月期间，患者的 BASDAI 没有观察到显着差异。ii)治疗前后BASFI的变化：在治疗3或6个月之前和之后观察到的患者的BASFI没有显着差异（均P>0.05；表I和表II ）。iii) 治疗前后 BASMI 的变化：治疗前 3 个月和治疗 6 个月后患者的 BASMI 没有显着差异（P>0.05；表 1 和表2 ））。治疗 6 个月后，患者的 BASMI 没有观察到显着差异。
图3：每位患者治疗前、后的红细胞沉降率（ESR）
图4：每位患者治疗前、后的CRP（C反应蛋白）水平
图5：治疗前、后的BASDAI评分
表1：治疗3个月前、后BASDAI、BASFI和BASMI的比较
表2：治疗6个月前、后BASDAI、BASFI和BASMI的比较
安全评价
输注 uMSC 后，60% 的患者 (3/5) 出现发烧（体温 38.5–39°C）。1例患者体温39℃，静脉注射地塞米松（齐鲁制药有限公司）5mg，肌肉注射盐酸异丙嗪25mg（齐鲁制药有限公司）。随后该患者的体温恢复正常。另外两名患者体温正常，不需要任何治疗。移植期间和移植后没有与 uMSC 输注相关的其他不良反应。这些结果表明 uMSC 输注对于 AS 患者是安全的。
讨论
AS 是一种自身免疫性疾病，会导致椎骨进行性强直和椎旁韧带骨化。AS 的确切发病机制尚不清楚，但许多分子参与了发病过程。TNF-α 在发病机制、激活炎症和破坏靶组织中发挥重要作用。此外，IL-23 诱导的 IL-17 分泌也发挥着重要作用。已证明此类患者血清中IL-17和IL-23的水平较健康人群有所升高。另外，CD4 + CD25 + CD127低Treg 细胞在 AS 中发挥作用。已确定活动性 AS 患者中 Treg 的比例低于健康对照者。AS 患者的 B 细胞亚群也存在异常。先前的研究表明AS患者体内存在多种类型的自身抗体，提示自身抗体可能与AS的发病机制相关。
由于间充质干细胞在免疫调节中发挥着重要作用，因此它们被用于治疗自身免疫性疾病，包括系统性红斑狼疮、多发性硬化症和同种异体造血干细胞移植后的急性移植物抗宿主病。已证明，MSC 可能有利于 Th2 表型 T 细胞的出现，并有效减少 Th1/Th17 细胞相关细胞因子 TNF-a 和 IL-17。MSC 还能够抑制人 Th17 细胞的活性，抑制天然 CD4 + T 细胞分化为 Th17 细胞，并显着抑制细胞因子的产生，导致 Tregs 上调。一种提出的机制是 MSC 诱导浆细胞样树突细胞产生 IL-10，进而诱导 Tregs。由于其多分化能力，MSC 可以诱导蛋白聚糖的合成并恢复椎间盘结构，还可以抑制 B 细胞功能。体外研究表明，MSC 可以阻止 B 细胞激活、增殖和分化为产生免疫球蛋白 (Ig) 的细胞。此外，间充质干细胞可能是心血管疾病的潜在治疗方法，包括缺血性心脏病和外周动脉疾病。间充质干细胞可以分化为产生胰岛素的细胞，因此可能有益于治疗 1 型糖尿病，这种糖尿病会导致胰腺 β 细胞破坏并减弱胰岛素的产生。间充质干细胞疗法也可能被认为是治疗肝纤维化等肝脏疾病的有效方法。间充质干细胞移植是治疗骨关节炎、骨坏死和骨再生的一种新方法。间充质干细胞能够分化成神经元，因此可用于治疗神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症、帕金森病和视网膜疾病。
参考文献
1、Smith JA and Colbert RA: Review: The interleukin-23/interleukin-17 axis in spondyloarthritis pathogenesis: Th17 and beyond. Arthritis Rheumatol. 66:231–241. 2014.
2、Zambrano-Zaragoza JF, Agraz-Cibrian JM, González-Reyes C, Durán-Avelar Mde J and Vibanco-Pérez N: Ankylosing spondylitis: From cells to genes. Int J Inflam. 2013:5016532013.
3、Hreggvidsdottir HS, Noordenbos T and Baeten DL: Inflammatory pathways in spondyloarthritis. Mol Immunol. 57:28–37. 2014.
4、Scarpa R, Costa L, Atteno M, Del Puente A, Caso F and Moll JM: Psoriatic arthritis: Advances in pharmacotherapy based on molecular target. Expert Opin Pharmacother. 14:2311–2313. 2013.
5、Fiocco U, Sfriso P, Oliviero F, Lunardi F, Calabrese F, Scagliori E, Cozzi L, Di Maggio A, Nardacchione R, Molena B, et al: Blockade of intra-articular TNF in peripheral spondyloarthritis: Its relevance to clinical scores, quantitative imaging and synovial fluid and synovial tissue biomarkers. Joint Bone Spine. 80:165–170. 2013.
6、Li A, Tao Y, Kong D, Zhang N, Wang Y, Wang Z, Wang Y, Wang J, Xiao J, Jiang Y, Jiang Y, et al: Infusion of umbilical cord mesenchymal stem cells alleviates symptoms of ankylosing spondylitis. Exp Ther Med 14: 1538-1546, 2017
