自然杀伤（NK）细胞

自然杀伤（NK）细胞可选择性地溶解细胞，而无需事先活化。NK细胞属于天然淋巴细胞（ILC），天然淋巴细胞作为天然免疫系统的一部分，对于免疫监视和随后的宿主防御病毒感染和癌细胞至关重要。在人体中，自然杀伤（NK）细胞占循环淋巴细胞的8-20%；在实验室的近交系小鼠中，NK细胞占脾脏和骨髓淋巴细胞的2-5%。与其他淋巴细胞（包括B细胞、T细胞和自然杀伤T（NKT）细胞）不同，NK细胞不表达克隆性B细胞受体或T细胞受体/ CD3ε复合体等抗原特异性受体。相反，自然杀伤（NK）细胞以抗原非依赖性方式（通常不会生成免疫记忆或长期保护性免疫）发挥作用。近期研究表明，NK细胞是癌症治疗的潜在治疗靶点。

NK细胞发育与表面标志物

人NK细胞发育

人NK细胞在骨髓（BM）和包括扁桃体、脾脏和淋巴结在内的次级淋巴组织（SLT）中发育及成熟。细胞发育分为六个不同阶段（表1）。第1阶段只发生在骨髓，而第2-6阶段可发生在骨髓或次级淋巴组织中。造血干细胞发育成具有淋巴样或髓样偏向的多能祖细胞（MPP）。MPP细胞将生成一个淋巴样祖细胞，该细胞首先发育成NK前体细胞，然后发育成未成熟NK细胞，最后发育为成熟NK细胞。NK前体细胞（NKP）只能分化为成熟NK细胞，而不能分化为T细胞、B细胞、髓样细胞或红系细胞。人NK细胞发育阶段主要基于CD34、CD117、CD56和CD94的表达水平。CD56表达增加是NK成熟的关键，紧随其后的是CD94/NKG2A表达。此外，白细胞介素2/15受体β（CD122）也是NK细胞发育后期的重要标志。

表1.人NK细胞发育阶段表达的细胞标志物。

第1阶段	第2阶段	第3阶段	第4阶段	第5阶段	第6阶段	第7阶段	第8阶段
CD34	CD34	CD7	CD7	CD7	CD7	CD7	CD7
CD133	CD38	CD34	CD45RA	CD244	CD244	CD244	CD244
CD45RA	CD10	CD45RA	CD244	CD117^dim	CD122	CD122	CD122
CD244	CD133	CD244	CD117	CD122	NKG2D	NKG2D	NKG2D
	CD45RA	CD117	CD122	NKG2D	CD335	CD335	CD335
	CD244	CD127	ILR1	CD161	CD337	CD337	CD337
	CD117	ILR1	CD335	CD335	NKG2A	NKG2A	NKG2A
	CD7	CD122	CD337	CD337	CD161	NKP80	NKP80
	CD127		CD161	NKG2A	CD56^Hi	CD161	CD161
			NKG2D	CD56^Hi	NKP80	CD16	CD16
						CD56^Low	CD56^Low
							KIR
							CD57
缩略语表：CD，分化簇；ILR，IL-1受体；NKG，自然杀伤细胞群。^Hi：高表达水平，^Low：低表达水平，dim：微弱表达。

NK细胞培养

大多数正常健康细胞表达主要组织相容性复合体（MHC）I类分子，该类分子将这些细胞标志物视为“自身”。当自然杀伤（NK）细胞抑制性受体识别同源MHC I类分子时，NK细胞的细胞毒性功能关闭从而阻止其杀死这些细胞。为获得识别“非自身”靶细胞（具有低MHC I表达）的能力，必须教育NK细胞使用同源抑制性受体检测宿主MHC I类分子，这一过程也被称为调节或许可。

NK细胞还可通过细胞因子的启动过程来适应环境，此类细胞因子包括IL-2、IL-15（由树突状细胞转化而来）、IL-18、IL-12和IFNα。与邻近细胞相互作用后各种通路（抑制和活化）的整合控制着调节NK细胞活化的动态平衡，并决定了NK细胞是否活化以杀死靶细胞和生成细胞因子。天然免疫系统通常被认为缺乏免疫记忆能力；然而最新调查结果表明，一些NK细胞可以存活很长时间，并对异常细胞或病毒具有强大的回忆反应

NK细胞受体：活化和抑制活性

NK细胞能够在无需预先激活的情况下进行免疫监视和宿主防御，因此细胞表面受体的表达至关重要。NK细胞可表达活化和抑制性受体，以及黏附受体。这些NK细胞受体充当感觉系统，并且此类受体的参与与随后的下游信号的平衡决定了细胞反应。

活化受体

成熟的循环性NK细胞（人：CD56+，小鼠：CD49b+）组成性地表达多种活化受体（表2）。NK细胞在免疫细胞中的独特之处在于，所有成熟循环NK细胞都组成性地表达FCRγ、CD3ζ和DAP12 I型跨膜锚定蛋白，这些蛋白以二硫键结合型的同源二聚体或异源二聚体（在FCRγ和CD3ζ情况下）的形式存在。最重要的是，这些蛋白质在其胞浆区含有免疫受体酪氨酸基活化基序（ITAMS）——由序列（D/E）XXYXX（L/I）X6-8YXX（L/I）定义，其中X代表任意氨基酸，斜杠分开可能占据一个给定位置的替代氨基酸，X6-8表示两个YXX（L/I）元素之间的任意6-8个氨基酸。DAP12和FCRγ含有一个ITAM，CD3ζ每个链含有三个ITAM。在这些蛋白质的短胞内结构域中没有其他已知信号基序，而ITAM酪氨酸残基的突变破坏了其信号功能。受体与配体结合后，再通过这些含含ITAM的分子促进下游信号传导。NK受体活化时，ITAM被Src激酶磷酸化，从而允许酪氨酸激酶Syk与Zap70结合并活化后者。

激活NK受体的一个重要家族是自然细胞毒性受体（NCR），包括NKp30、NKp44和NKp46。受到刺激时，这些受体向NK细胞传递有效信号，最终溶解有害细胞并生成炎性细胞因子（如IFNγ）。NCR表达于成熟的循环NK细胞，在控制各种病毒感染和癌症方面起着关键作用。

第二个重要活化受体NKG2D的独特之处在于，在人NK细胞上表达时，其与胞内衔接蛋白DAP10相关联以启动不同的信号级联。DAP10含有一个YINM基序，能与PI3K结合并活化它。此外，DAP10能识别Vav1，而Vav1与Grb2相关。NKG2D从最早的NK细胞前体阶段开始表达，除了在溶细胞活性中起作用外，NKG2D还参与诱导其他激活性NK受体的上调。

表2.NK细胞活化受体。

受体	配体	胞内衔接	物种
KIR2DS1	HLA-C	DAP12	H
KIR2DS2	病毒解旋酶	DAP12	H
KIR2DS4	病毒解旋酶，HLA-Cw4	DAP12	H
NKG2C/E/H	HLA-E	DAP12	H, M
NKG2D	MICA，MICB，ULBP1	DAP10	H, M
CD16	IgG	CD3ζ/FCRγ	H, M
NKp46/LY94	病毒HA	CD3ζ/FCRγ	H
CD122	IL-2，IL-15	SHC1	H, M
NKp44	病毒HA	DAP12	H
名词缩写表：DAP12，12 kD的DNAX活化蛋白；FCRγ，IgE受体Ig的Fc片段；HA，血凝素；H，人；HLA，人白细胞抗原；IL，白细胞介素；KLRG，杀伤细胞免疫球蛋白样受体；M，小鼠；MICA，主要组织相容性复合体（MIC）I类链相关蛋白A；MICB，主要组织相容性复合体（MHC）I类链相关蛋白B；NKP，自然杀伤细胞祖细胞；NKG，自然杀伤细胞群；SHC1，SHC衔接蛋白1；ULBP1，UL16结合蛋白1。

抑制性受体

NK细胞抑制性受体（表3）让NK细胞维持在非活性状态。一些NK抑制性受体对MHC I类分子具有特异性，而另一些则可以结合非MHC配体。其中一些NK抑制性受体（如杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）和白细胞免疫球蛋白样受体（LILR））属于免疫球蛋白超家族的单体I型糖蛋白，而Ly49和CD94-NKG2A受体等其他受体则是具有C型类凝集素支架结构的II型糖蛋白。所有抑制性受体在其胞浆区都含有一个共同的免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）。

表 3NK细胞抑制性受体。

受体	配体	物种
KIR2DL1/2/3	HLA-C	H
KIR3DL1/2	HLA-A/C	H
NKG2A/B	HLA-E	H,M
LIR1	HLA 1类	H
SIGLEC3/7/9	唾液酸	H
KLRG1	钙黏蛋白	H,M
名词缩写表：H，人；HLA，人白细胞抗原；IL，白细胞介素；KLRG，杀伤细胞免疫球蛋白样受体；LIR，白细胞免疫球蛋白样受体；M，小鼠；NKG，自然杀伤细胞群；SIGLEC，唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素

黏附受体

大多数NK细胞驻留在脉管系统中，因此它们必须发生外渗并迁移到炎症、感染或肿瘤发生的部位。黏附受体（表4）对于这一过程至关重要，在NK细胞活化后，这些受体的表达增加。

表4.NK细胞黏附受体。

受体	配体	物种
LFA2	CD48、CD58	H, M
LFA1	ICAM-1	H, M
Mac1	ICAM-1	H, M
CD56	N-CAM	H
CD61	纤连蛋白	H, M
名词缩写表：CD，分化簇；ICAM，细胞间黏附分子；LFA，淋巴细胞功能相关抗原；H，人；M，小鼠；Mac1，巨噬细胞-1抗原。

NK细胞实验方法

人NK细胞分离

人原代NK细胞可从外周血单核细胞（PBMC）中分离出来。从人血或外周血白细胞中分离PBMC，后续使用磁珠细胞分选NK细胞。流式细胞仪分选NK细胞也可以替代Invitrogen Dynabeads磁珠细胞分选方法。CD56和CD16是人NK细胞的特异性标志物，可以鉴别和分离不受其他淋巴细胞污染的NK细胞

NK细胞中的CD56表达水平决定表型特性。CD56Low/CD16Hi（CD56偏低/CD16偏高）NK细胞构成大部分循环性NK细胞；CD56HiCD16−/Low NK细胞占较小部分。CD56Hi NK细胞在IL-12的刺激下增殖并生成细胞因子。CD56Low NK细胞更具细胞溶解能力，当其活化受体参与时，可生成大量细胞因子。CD56Low NK细胞与CD56Hi NK细胞有所不同。NK细胞在活化和抑制受体表达方面属于异质性群体。

培养的NK细胞与体内分离细胞表现不同，并且表达不同的NK细胞表面标志物。用IL-2培养的NK细胞将在CD57−CD56Low NK细胞亚群中诱导CD57表达。CD57+NK细胞高度成熟并具有多种特性，包括细胞毒性、对CD16刺激的敏感性、对细胞因子的较低反应性和增殖性。

用CD56和CD16细胞标志物物鉴定并分离NK细胞。（1）提出分选方案，显示所有PBMC群体。（2）使用FSC和SSC对群体进行淋巴细胞门控，然后对淋巴细胞进行CD3负门控。（3）细胞分为CD56^高和CD56^低群体或CD56⁺正门控，并分为CD57^高和CD57^低群体。

NK细胞培养

人原代人NK细胞最多可培养8周。NK细胞可在添加有10%人AB⁺血清、2 mM GlutaMAX-I、1 mM丙酮酸钠、100 U/mL rIL-2和25U/ml rIL-15的1640培养基中保存。在植物血球凝集素（100ng/mL）存在的情况下，通过与受照射K562细胞共同培养6-9天来实现NK细胞扩增。NK细胞应用于CD56⁺/ NKG2D^+高，并在含100ng/mL植物血球凝集素的RPMI完全培养基中与受照射K562共同培养。K562细胞应接受照射（6000拉德），以防止原代NK细胞增殖过程中的靶细胞增殖。

也可以使用不含滋养层细胞试剂盒扩增培养

细胞因子谱

虽然单个细胞因子能发挥一些作用，但NK细胞的完全活化、增殖、存活和效应功能通常需要不同细胞因子的组合。正调节NK细胞功能的细胞因子包括IL-2、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21和IFG-g（主要由Th1细胞、巨噬细胞和树突状细胞生成）。相比之下，细胞因子IL-4、IL-5和IL-10（由Th2细胞分泌）或者IL-1β、IL-6、IL-10、IL-23、IL-35和TGFβ（由肿瘤细胞分泌）可抑制NK细胞功能。

表5：参与NK细胞活化、抑制和分泌的关键细胞因子。

	活化	抑制	分泌
细胞因子和趋化因子	IL-2，IL-15，IL-12，IL-18和IL-21 IFG-g	IL-4，IL-5，IL-1β，IL-6，IL-10，IL-23，IL-35，TGF-β	IFN-γ，TNF-α，GM-CSF，IL-10，IL-5和IL-13，MIP-1α，MIP-1β，IL-8，RANTES
其他因素			颗粒酶-A，-B，&-M，穿孔素

NK细胞的发育至少有五个不同的阶段，在这些阶段中各种细胞因子受体的表面表达表明不同的细胞因子与从一个发育阶段过渡到下一个发育阶段有关此外。活化NK细胞可分泌多种细胞因子和趋化因子，其中包括GM-CSF、IL-10、IL-5、IL-13、IFN-γ、RANTES、TNF-α、MIP-1α、MIP-1β和IL-8（可使用免疫测定法测量）。此外，NK细胞上表达的免疫检查点标志物（如LAG-3、CD96、TIM-3、TGIT和PD-1）都能在血清或血浆中检测到。

NK细胞的细胞毒性

人NK细胞毒活性的定量测定可使用靶细胞-K562来确定。靶细胞和NK细胞应在经细胞培养处理的培养板上共培养，在4℃温度下于HBSS中用5µg/mL纤连蛋白包被过夜。然后在每个孔中添加密度为1x10⁵（K562）的靶细胞，并添加10ng/mL SDF-1α 后于37℃下粘附1小时。然后用HBSS冲洗孔板。将HBSS中密度为5x10⁵的NK细胞添加到每个孔中（一式三份），并在37℃下培养。细胞毒性可通过荧光成像检测分析。

参考文献

ꄴ前一个：无

ꄲ后一个：无